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逆轉(zhuǎn)錄酶怎么選?

 更新時(shí)間:2023-12-15 點(diǎn)擊量:665
  逆轉(zhuǎn)錄酶(Reverse Transcriptase)是一種用于從RNA模板生成互補(bǔ)DNA(cDNA)的酶,是cDNA合成和RT-qPCR反應(yīng)中的核心酶,其合成的cDNA可以直接作為PCR,qPCR,LAMP和測(cè)序等檢測(cè)的模板。那么你知道該如何選擇逆轉(zhuǎn)錄酶嗎?讓我們一起來(lái)看看吧!
  一、逆轉(zhuǎn)錄酶活性
  逆轉(zhuǎn)錄酶主要包括以下三種活性:
  ①逆轉(zhuǎn)錄活性:以RNA為模板,催化dNTP聚合,生成DNA-RNA雜合雙鏈。
 ?、赗Nase H活性:水解雜合雙鏈中的RNA,得到與RNA互補(bǔ)的DNA單鏈(cDNA)。
  ③DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性:以cDNA單鏈為模板,以dNTP為底物,再合成雙鏈DNA。
  二、決定最佳逆轉(zhuǎn)錄酶的幾個(gè)關(guān)鍵重要特性
  1.熱穩(wěn)定性
  耐高溫能力是cDNA合成的一個(gè)重要方面,因?yàn)楦邷赜兄谑咕哂袕?qiáng)二級(jí)結(jié)構(gòu)和/或高GC含量的RNA變性,從而實(shí)現(xiàn)全長(zhǎng)cDNA合成和更高產(chǎn)量。
  野生型MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶在37°C下表現(xiàn)最佳,而加工改造后的熱穩(wěn)定性MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶可以承受高達(dá)55°C的溫度,而不會(huì)對(duì)逆轉(zhuǎn)錄效率產(chǎn)生負(fù)面影響。
  2.RNase H活性
  RNase H(核糖核酸酶H)是一種切割并降解RNA-DNA雜交鏈中RNA鏈的酶,同時(shí)可以保持DNA鏈的完整。
  如果逆轉(zhuǎn)錄酶的RNA酶H活性過(guò)高,則會(huì)導(dǎo)致RNA模板的過(guò)度降解,引起cDNA合成不完整或效率低下。具有低RNase H活性的逆轉(zhuǎn)錄酶可以最大限度地減少反應(yīng)中RNA分子的非特異性降解,提高cDNA合成的特異性和保真度。
  由于RNA模板在全長(zhǎng)逆轉(zhuǎn)錄完成之前可能被降解,RNase H活性是長(zhǎng)片段cDNA合成過(guò)程中需要規(guī)避的因素。RNase H活性還可能會(huì)與逆轉(zhuǎn)錄酶中的活性聚合酶競(jìng)爭(zhēng)從而降低逆轉(zhuǎn)錄效率。為了更好地合成cDNA,通過(guò)在逆轉(zhuǎn)錄酶的RNase H結(jié)構(gòu)域中引入突變,逆轉(zhuǎn)錄酶的RNase H活性降低甚至完q消除。這種突變常??梢栽黾娱L(zhǎng)鏈cDNAs的產(chǎn)量,促進(jìn)其合成。
  3.持續(xù)合成能力
  持續(xù)合成能力是指在酶的單個(gè)結(jié)合事件中摻入的核苷酸數(shù)量。持續(xù)合成能力強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)錄酶可以在更短的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)合成更長(zhǎng)的cDNA鏈。大多數(shù)經(jīng)過(guò)改造的逆轉(zhuǎn)錄酶具有更強(qiáng)的合成能力(比野生型MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶高65倍)。
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